- [2017/7/26] 向基因編輯邁前一步:CRISPR-Cas9基因編輯技術與亨汀頓舞蹈症(HD)
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進化的CRISPR-Cas技術現已可用於編輯活鼠腦內HD基因。由 Leora Fox於2017/7/26撰寫,Dr Jeff Carroll編輯。
CRISPR-Cas9是一種試驗性的基因編輯技術,用以製作精確的DNA改變。這是第一次科學家使用此技術,來攻擊活鼠腦細胞中亨丁頓舞蹈症的變異基因。其他研究者正試著改善CRISPR-Cas9技術,使其更有效、更精準與安全。雖然距離應用於HD病患身上還有很長一段時間,但能於小鼠身上測試仍是令人振奮的一大發展。
以CRISPR-Cas9進行基因編輯
DNA是活細胞生長與其功能的基礎編碼。我們能複製這種編碼的能力-這曾僅存於科幻小說當中-現已用於遺傳性疾病的研究當中,例如亨汀頓舞蹈症。用以改變DNA的方法稱為基因編輯,目前最受到矚目的一種稱為CRISPR-Cas9。從其問世之後,HD科學家就探索將CRISPR-Cas9用於移除導致HD的變異基因的可行性。
基因編輯技術可讓DNA編碼產生永久的改變
這種試驗室宴中的技術目前尚未能應用於人體,但以快速從試管中的細胞發展到生物體。多個研究團隊的研究顯示,CRISPR-Cas9技術已能用於編輯活鼠腦中的HD基因。更令人振奮的是,其中一個試驗室最新的發現顯示,當CRISPR-Cas9技術用於腦部之後,HD老鼠的行為改善了。
這種基因編輯技術將會持續變得更加成熟,已有數個HD研究團隊將其應用於HD療法的挑戰之中。接著讓我們來談談CRISPR-Cas9是如何運作,在HD的應用以及為何現階段安全性是考量的重點。
HD基因編輯研究的歷程
HD是因為基因編碼中不必要的添加所導致。DNA編碼中充滿了數以百萬計的生物堆疊塊,由C, G, A, T核苷酸所構成。這些核甘酸是以一個一個區塊形式來展現或是被辨識-即基因當中被稱為外顯因子(exons)的形式。
你可將核苷酸視為字母,三個核苷酸構成一個單字,一個外顯因子(exon)即是一個句子,基因則是一個段落,基因組(genome)就是描述細胞如何生長與作用的操作手冊。
接著讓我們聚焦於導致HD的基因。立志從事HD的研究人員當中,第一句包含著錯誤即:一股C-A-G比起比起比起比起比起比起所需次數複製更多。想想看,如果我們能編輯CAG片段的複製錯誤,就像刪除上一句當中重複的”比起”字樣?這就是HD的基因編輯所聚焦之處,而CRISPR-Cas9則是數種方法中的一種。
CRISPR-Cas9: 用以裁剪
尚無相對的文字可描述基因編輯的軟體。CRISPR-Cas9的作用在於能以微觀規模修復基因,一次一個細胞,將錯誤編碼定位並將之刪除。此種剪裁過程需要兩個要素 (1)導引RNA (2)剪裁酵素:Cas9 可將之簡喻為:想像你想剪一段彩帶,而你朋友有一把剪刀。你可用雙手將彩帶拉直,並向你朋友展示需要剪裁之處。這就是微觀規模下著CRISPR-Cas9:導引RNA找到並呈現DNA上的位置,而Cas9如同剪刀一般剪裁,即剪裁DNA。
在試驗室中,科學家能設計獨特的導引RNAs,用以導引Cas9將HD基因當中,過長的C-A-G片段頭尾剪裁掉。而新的端點可結合在一起,永久移除造成異常的片段。這就是科學家如何運用CRISPR-Cas9來編輯基因序列。
對於一個令人振奮的新技術而言,研究人員早就在研究如何將CRISPR-Cas9系統用於新的使用方式。
早期時,研究人員發現它們能使用CRISPR-Cas9來輕鬆對特定基因做單一剪裁。用在修復剪裁過程的細胞容易出錯,常造成傳遞遺傳資訊的微小片段遺失。舉例來說,你在餐桌上對朋友傳訊"please pass the butter",你將其中的le刪除,但是保持句子的結構,句子將會變成”pasepa ssth ebu tterxx”。當基因的訊息因微小的刪除而跳成類似狀況,細胞具有辨識與忽略錯誤之處的機制。這讓研究人員能更有效的運用CRISPR-Cas9來刪除基因,而非以更具的方式編輯序列。
運用CRISPR-Cas9於HD小鼠腦中
數個研究團體發現有可能對於小鼠腦中的HD基因進行編輯。近期,美國Emory大學的Xiao-Jiang Li團隊發現對於HD基因進行細微剪裁,對於HD小鼠能有正向影響。在相關研究當中,他們使用CRISPR-Cas9進行刪除模式,而非以編輯HD基因的方式來移除過長的C-A-G片段。在HD小鼠身上運用CRISPR-Cas9時,導引RNA與Cas9”剪刀”藉由特殊設計的病毒所攜帶,並僅能以注射方式進入小鼠腦中。Li的團隊將這技術運用於紋狀體,紋狀體是大腦中控制情緒與運動的區域,往往在HD病程中受到破壞。幾週之後,CRISPR-Cas9要素散佈到許多細胞中,終止了異常HD基因的功能,而神經元的壓力訊號也顯示減少了。
三個月之後,腦細胞中有害的亨汀頓蛋白質(huntingtin protein)的堆積也減少,HD小鼠的運動測試表現也有所改善。
最令人振奮的部分是在已有症狀的老年小鼠身上的發現。九個月大(接近中年)的小鼠在接受注射之後症狀改善了,這暗示著即使經過了半輩子的損傷,小鼠的大腦功能能部分回復。
須謹慎運用
多數患有HD的患者僅有一個突變基因的複製,另一個複製通常是正常的。運用CRISPR-Cas9技術的擔憂就是,它可能刪除掉HD基因當中的受損部位,也可能刪除正常複製的部位。Li的實驗室也做了相關的研究間接的討論這個問題。在帶有兩個錯誤複製的HD基因小鼠身上,利用CRISPR-Cas9移除這兩段錯誤片段。在僅有數週的觀察當中,未發現對於小鼠有立即的傷害。“這試驗最令人振奮的部分就是發現較年長的小鼠症狀有改善”
對於影響HD基因正常複製片段的安全性是重要的,特別是進行中的降低亨汀頓變異蛋白的ASO試驗。
此藥物能降低變異與健康的HD基因複製濃度。有些小鼠的研究認為對於餘生是無害的,但是因為小鼠生命週期比人類短許多,因此難以被確認是否對人體無害。
進行ASO研究的公司-羅氏與Ionis都清楚這個風險,因此小心的觀測受試者是否會出現因降低了HD基因而產生的問題。
ASO藥物與CRISPR-Cas9方法有其他的顯著差別。現行的ASO試驗是關於降低亨汀頓變異蛋白,又稱為基因沉默療法,藉由短時間內使HD基因的功能失效來達到目的。治療停止之後,基因又會回復其功能。
相反的,利用CRISPR-Cas9來編輯會產生永久性的DNA改變,因此必須更加的謹慎小心。有證據顯示,HD基因無論受損與否,在細胞功能都扮演重要腳色,因此我們不希望具有永久傷害的風險。好消息是,研究HD的科學家嘗試著避免傷害基因正常複製的方法,例如等位基因特異性(allele-specific approach)的方式。
改進基因編輯技術
近期有兩個團隊改進了CRISPR-Cas9技術,將其用以剪裁並讓基因上受損的複製片段不活化。由Massachusetts 醫院的Jong-Min Lee帶領的團隊非常聰明的利用特別設計的指引RNAs進行了等位基因特異性的刪除(allele-specific deletion)。指引RNAs會尋找靠近HD變異處的DNA片段,藉此可進行兩個Cas9的切除。此方法是非常新穎的,因為代表可依個體的DNA進行個人化的基因編輯。而第二個團隊,由Philadelphia兒童醫院(Children’s Hospital of Philadelphia)的Beverly Davidson領軍的團隊,運用類似的技術得以僅標記在突變的基因,並以Cas9技術進行較小的切除。此技術可阻止有害的亨丁頓變異蛋白生成。如同Li的團隊,他們也能使活鼠腦中的HD基因不活性化。儘管更新的CRISPR技術是否能改善HD小鼠的行為仍有待觀察,上述的創新技術都讓未來基因療法向前邁出一步。
基因編輯的挑戰
我們很興奮能藉由基因編輯的技術來更了解HD。運用CRISPR技術在活鼠以及發展等位基因特異性(allele-specific )技術雖然代表著向前邁進一大步,但是仍有數個障礙在運用CRISPR-Cas9技術於HD治療前,需要被克服。以下是就我們所了解,研究人員可能會面臨到的挑戰:- 準確度(Precision): 確保Cas9技術僅會切割它所被設計切割的部位,而不會隨機切割其他地方造成傷害。科學家正在確保CRISPR特異性的研究道路上。
- 等位基因的特異性(Allele-specificity): 確保僅有HD基因的變異部位複製而非正常的部位被移除。我們剛剛所介紹的就是令人振奮的向前一步的研究。
- 傳遞系統(Delivery): 讓CRISPR-Cas9技術進入腦部中的許多神經元並移除HD的基因。我們目前可知在老鼠身上是可行的,但要用在人類腦部中的治療仍是一大挑戰。
- 短期安全性(Short-term safety): 確保刪除HD基因的部分不會造成立即神經傷害甚至造成死亡。目前似乎仍未見傷害。
- 長期安全性(Long-term safety): 確保編輯HD基因能長期安全。而這議題在小鼠身上很難體現。我們或許能從靈長類的試驗或是臨床試驗中較非常駐的技術來找到答案。